Tendencias y retos de la metrología en la determinación de biomarcadores de exposición humana a sustancias químicas

Juan José Ramos Rodríguez⁽¹⁾, Cristina Grande Vicente⁽¹⁾, Susana Pedraza Diaz⁽¹⁾, Marta Esteban López⁽¹⁾, Argelia Castaño Clavo⁽¹⁾, Ana Isabel Cañas Portilla
⁽¹⁾Instituto de Salud Carlos III, Centro Nacional de Sanidad Ambiental

1. Introducción

Hay múltiples factores ambientales externos (físicos, químicos y biológicos) que pueden afectar a su salud. La organización mundial de la salud (OMS) estima que 12,6 millones de personas mueren al año como consecuencia de la insalubridad del medio ambiente y más de 100 enfermedades, entre ellas un 20% del total de casos de cáncer, pueden estar asociadas con estos factores ambientales [1]. Entre ellos, la exposición a sustancias químicas tiene un peso importante en esta problemática. Un reciente estudio llevado a cabo por el ISGlobal sitúa a la ciudad de Madrid como la ciudad europea con un mayor número de muertes atribuibles a la contaminación del aire y partículas en suspensión [2]. Según señala el Convenio de Rotterdam sobre la comercialización de sustancias químicas peligrosas, 1,6 millones de muertes al año están causadas por una mala gestión de los productos químicos y sus residuos (http://www.pic.int).

La característica de la exposición humana a productos químicos está en constante evolución, influenciada por diferentes factores como la evolución y modernización de la industria química, las demandas y necesidades sociales, los patrones de consumo y el marco regulatorio vigente en cada momento. 

Así, después de la segunda guerra mundial, gracias al potente desarrollo que la industria química experimentó durante este periodo y a los cuantiosos excedentes de productos químicos, principalmente clorados, se generalizó el uso de sustancias cloradas para el control de plagas y en aplicaciones industriales. Los primeros plaguicidas organoclorados, como el dicloro difenil tricloroetano (DDT), fueron empleados de forma masiva desde finales de los años 40, lo que dio lugar a un incremento muy relevante de la producción de alimentos. En cuanto a las aplicaciones industriales, los bifenilos policlorados (PCBs) una familia formada por 209 compuestos diferentes, extendieron su uso debido a su alta estabilidad térmica, empleándose en intercambiadores de calor y fluidos dieléctricos, en transformadores, condensadores o estaciones rectificadoras. En la década de los 70 y 80, también con la contribución del desarrollo de técnicas instrumentales de medida, surgen las primeras sospechas sobre la toxicidad y persistencia de estos compuestos, lo que da lugar a la primera ley que regula estos contaminantes en 1972 con la prohibición del DDT en EE.UU. Estas familias de contaminantes orgánicos, después denominadas Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs) fueron las primeras, junto con algunos metales pesados como el plomo, que generaron un amplio interés científico, toxicológico, social y legislativo.

En las últimas décadas, la creciente demanda de productos de consumo y el gran desarrollo de la industria relacionada con la fabricación de polímeros, presentes en un amplio rango de aplicaciones, ha contribuido a cambiar el perfil de la exposición a los contaminantes ambientales. Se estima que la producción mundial de plástico superó los 348 millones de toneladas en 2017 y unos 13 millones de toneladas se filtran en los océanos cada año [3]. Entre las sustancias que forman parte de los aditivos añadidos a los plásticos están: los retardantes de llama, colorantes, plastificantes, endurecedores, anti-oxidantes, anti-espumantes, catalizadores, filtros ultravioletas entre otros, y pueden estar presentes en productos de consumo como envases, materiales de cocina, materiales de construcción, mobiliario y en todo tipo de aparatos eléctricos y electrónicos pudiendo ser liberados al medio durante la vida útil del producto [3]. Además, estos aditivos pueden estar presentes en productos de limpieza, higiene y cuidado personal parte de estos. Entre las familias de contaminantes orgánicos relacionados con estos productos y que despiertan un mayor interés están los sustancias perfluoroalquiladas y polifluoroalquiladas (PFAS), el bisfenol A (BPA), los retardantes de llama organofosforados, retardantes de llama organobromados y los ftalatos [4]. Por otro lado, continúan siendo de gran interés plaguicidas como los organofosforados o piretriodes, además, de otros contaminantes ambientales que pueden ser emitidos como productos secundarios en procesos industriales o domésticos, en especial p. ej. los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) o las dioxinas y furanos.

Nos encontramos, por tanto, en un escenario complejo, ya que junto a las sustancias “históricas”, que, por su persistencia continua a niveles detectables en la población general, la exposición a sustancias químicas involucra a una mezcla compleja compuestos, muchos nuevos o emergentes, a las que estamos expuestos de forma simultánea y constante. Por otro lado, el carácter menos persistente de muchos de estos compuestos hace que sus biomarcadores de exposición, en lugar de ser la sustancia en su forma nativa, sean el metabolitos o metabolitos que genera en el organismo. Esto implica la necesidad de conocer las rutas metabólicas y la toxicocinética en nuestro cuerpo para una correcta evaluación de la exposición.

La relación efecto tóxico-concentración hace de los datos experimentales un pilar básico de este control y evaluación en salud ambiental. La gran mayoría de la legislación, restricciones y medidas para la protección de la salud y el medio ambiente basan su estrategia en el establecimiento de límites y valores relacionados con las concentraciones (valores guía en salud, valores referencia, límites máximos permitidos, carga tóxica total, ingesta diaria tolerable…). Estos niveles son cada vez más estrictos e implican la necesidad de determinar cada vez más compuestos y cada vez más matrices y a concentraciones cada vez más bajas. Aquí, la metrología, como ciencia que se ocupa de las mediciones, unidades de medida, de los equipos y procedimientos, encara importantes retos.

La metrología aplicada en este campo al análisis de muestras humanas, es decir a la identificación y/o determinación cuantitativa de productos químicos y/o sus metabolitos en muestras biológicas se denomina biomonitorización humana (BMH). Los estudios de BMH son una excelente herramienta en esta situación, ya que permite realizar una valoración integrada de la exposición al integrar todas las posibles vías y fuentes de exposición y conocer el grado de exposición del individuo. Además, en población general es eficaz para i) evaluar el grado de aplicación de medidas restrictivas, ii) estudiar o descubrir la presencia e incidencia de contaminantes emergentes, iii) evaluar tendencias temporales o diferencias territoriales, iv) identificar grupos de población altamente expuestos o vulnerables, v) encontrar determinantes asociados con la exposición. En definitiva, convertirse en un soporte para las administraciones a la hora de elaborar o implementar medidas de protección para la salud. Sin embargo, a pesar de estas ventajas, esta aproximación cuenta con algunas limitaciones éticas y técnicas derivadas de la propia naturaleza de las muestras a analizar. 

En base a lo anterior se presentan los principales retos de la metrología en la determinación de estos biomarcadores de exposición en muestras humanas y las tendencias que han surgido para dar respuesta a estas necesidades. Estos retos se presentan agrupados en los apartados de análisis instrumental, preparación de muestra y aseguramiento de la calidad, si bien tienen puntos en los se interrelacionan.

2. Análisis instrumental 

Reto 1. Procedimientos analíticos para la identificación y/o determinación de contaminantes emergentes.

Una consecuencia de las restricciones en el uso y aplicación de determinados productos químicos como consecuencia de su potencial toxicidad en el medio ambiente y en humanos, es la puesta en el mercado de alternativas o sustitutos más seguros. Estas alternativas pueden pertenecer a la misma familia de compuestos y compartir una gran similitud estructural. Un claro ejemplo es el Bisfenol A, usado como aditivo de polímeros como el policarbonato. A raíz de las restricciones en productos como juguetes, biberones, tetinas y productos poliméricos en contacto con alimentos (Reglamento UE, 2018/213), este compuesto ha sido sustituido por otros bisfenoles como el BPF, BPS, BPFS[4]. En otras ocasiones, las nuevas alternativas corresponden a compuestos químicos nuevos y estructuralmente diferentes al original pero que proporcionan similares propiedades por ej. el plastificante Hexamoll Dinch en sustitución de ftalatos regulados [6].

Para estos contaminantes emergentes y sus metabolitos, en muchos casos, no existen metodologías analíticas debidamente validadas y robustas. Por lo tanto, es necesario desarrollar procedimientos instrumentales para identificar estos nuevos compuestos y cuantificar de forma precisa estos contaminantes emergentes y/o sus metabolitos en el ser humano. Para abordar este reto, la tendencia es el empleo de detectores que, además de presentar una alta sensibilidad, puedan ser o muy selectivos o que permitan dilucidar de forma precisa la estructura de un compuesto por su alta resolución. Por lo tanto, la tendencia ha sido doble mediante análisis dirigidos y no dirigidos. 

1. Cuando se conocen los contaminantes emergentes y se quiere tener información sobre compuestos concretos a bajas concentraciones, la aproximación más empleada sería el desarrollo de nuevos procedimientos o la adaptación de otros existentes, usando técnicas cromatográficas acopladas a detectores de alta especificidad como la espectrometría de masas en modo tándem (MS/MS). Estos análisis dirigidos se denominan “target analysis” y suelen ir precedidos de métodos de preparación de muestra selectivos para evitar posibles interferentes y disminuir el efecto matriz. Una correcta optimización permite alcanzar una elevada sensibilidad. Permite el análisis de muchos compuestos, pero de una misma familia o de familias con similares características [4], y es imprescindible disponer de material certificado de los compuestos para su identificación y cuantificación. Un ejemplo interesante es la reciente optimización y validación de un método para la determinación mediante LC-MS/MS de 11 metabolitos de plastificantes emergentes en orina y suero [7]
   
   
2. La otra tendencia es el análisis no dirigido, en el que se realiza la búsqueda de compuestos sin necesidad de conocer a priori lo que vamos a encontrar. A esto se le denomina “non target analysis”. En este caso es necesaria una instrumentación específica que nos permita conocer la estructura química sin necesidad de patrones. Los MS de alta resolución o de “masas exactas” son los que nos proporcionan, gracias a su configuración y su velocidad de adquisición, el espectro completo de cada señal obtenida. Gracias a programas de desconvolución y a librerías de compuestos generadas también en alta resolución podemos realizar la identificación de un número muy elevado de compuestos diferentes. Los modelos más empleados son el cuadrupolo acoplado a espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (qTOF) y el Orbitap, patentado por Thermo Scientific. Son cada vez más empleados para encontrar contaminantes emergentes o no esperables en muestras humanas [8]. En este caso, los métodos de preparación de muestra, al no estar buscando una familia determinada, son genéricos, evitando cualquier discriminación en etapas de purificación. Su limitación reside principalmente en la cuantificación ya que, aunque permite realizar una estimación semi-cuantitativa, la cuantificación precisa requiere también de patrones. Con esta estrategia, se ha llevado a cabo la búsqueda de casi 700 compuestos ácidos orgánicos, entre los que se encontraban los metabolitos de ftalatos y bisfenoles, así como de desconocidos en suero de mujeres embarazadas mediante LC-QTOF/MS [9]. 

También ambas aproximaciones pueden ser complementarias, por un lado, realizar un barrido amplio e identificar la presencia de compuesto de interés y luego realizar su cuantificación mediante métodos dirigidos.

Reto 2. Exposición a múltiples familias de contaminantes de forma simultánea. Procedimientos multiresiduales. 

Para abordar un escenario realista de la exposición humana debemos considerar que estamos expuestos a una mezcla muy compleja de contaminantes de diferentes características, presentes en general, en el medio a concentraciones muy bajas. La tendencia de la metrología es proporcionar procedimientos que permitan el análisis cuantitativo de decenas o centenares de analitos en una sola inyección. Para ello, se hace imprescindible disponer de métodos de preparación de muestra, con una baja especificidad, pero que proporcionen extractos lo suficientemente limpios para análisis mediante MS/MS. Algunas de las aplicaciones más relevantes de los últimos años para muestras humanas son, por ejemplo, la determinación de 260 plaguicidas en muestras de orina mediante LC-MS/MS [12], la validación de una metodología para la determinación de 379 plaguicidas en muestras de suero [13] o el análisis de 85 COPs en suero humano mediante GC-MS/MS [15]. En general son necesarias dos inyecciones ya que se suelen analizar los extractos mediante los diferentes tipos de ionización que permita la MS.

En la primera década del siglo XXI a fin de incrementar la capacidad cromatográfica de separación y allanar las posibles incertidumbres que puede generar el proceso de desconvolución, se desarrolló la cromatografía de gases completa en dos dimensiones (GCXGC) [10]. Esta técnica instrumental, permite la separación cromatográfica completa de un extracto en dos columnas capilares de diferentes polaridades. El resultado son cromatogramas estructurados por familias de contaminantes, por ejemplo, separación de diferentes familias de contaminantes orgánicos persistentes [11]. En los últimos años esta capacidad de separación, acoplada a detectores de tiempo de vuelo (TOF), se ha usado también “non-target analysis”, por ejemplo, para la búsqueda de desconocidos en muestras de leche materna mediante GCXGC-TOF lo que dio lugar a la identificación de 172 compuestos orgánicos de origen antropogénico [14] 

3. Preparación de muestra

Reto 3. Limitaciones de las muestras humanas 

Las muestras humanas lógicamente presentan unas características especiales en comparación con otras como las medioambientales o de alimentos. En primer lugar, debe ser representativa de la exposición que se pretende evaluar, lo que implica conocer la distribución y rutas metabólicas de los compuestos en el cuerpo. También el tipo y la forma de toma de muestra influye en la extensión de estudios BMH, habida cuenta de la participación voluntaria y altruista de los participantes. A ello hay que añadir los aspectos éticos y técnicos en la obtención de muestras invasivas como la sangre, sobre todo cuando se aborda el análisis en sectores de la población especialmente vulnerable como son los niños y lactantes. Además, la limitación en la cantidad de muestra disponible afecta a los límites de detección y cuantificación y puede hacer inviable la determinación de algunos compuestos si no se realiza una mezcla o pool de muestras, como ocurre en el análisis de algunos PCBs y de dioxinas y furanos [17].

Las matrices más empleadas son la orina y la sangre (plasma o suero), y en casos concretos la leche materna. Por lo general, para aquellos biomarcadores de exposición que son liposolubles y persistentes, las muestras de suero (plasma) o leche materna son las matrices más idóneas, por ej. PFAS, COPs, retardantes de llama. Mientras que los más polares y no persistentes, debido a los rápidos procesos de metabolización y/o excreción, se analizan preferiblemente en orina, bien en su forma nativa como el caso BPA o a través de los metabolitos que se generen como ftalatos o HAPs.

Para abordar este reto, se han seguido desde hace ya varios años dos estrategias. Desarrollo de procedimientos con matrices humanas no invasivas y la reducción de los volúmenes gracias a la miniaturización y automatización de las etapas de preparación de muestras.

1. En relación con muestras humanas alternativas, algunos ejemplos de las que han requerido un mayor interés en los últimos años son las siguientes:
   
   Las uñas, recientes estudios presentan procedimientos para la determinación de 16 HAPs y 12 metabolitos de hidroxilados HAPs mediante LC-MS/MS y GC-MS/MS [18], o para la determinación y comparación de niveles de PCBs y retardantes de llama bromados en población rural, urbana, y trabajadores de la industria de residuos eléctricos [19]. En la muestra de saliva podemos destacar el análisis de compuestos volátiles y bisfenoles [21] así como, la determinación de biomarcadores orgánicos y metales con carácter neurotóxico en población vulnerable [20]. En pelo se han estudiados diferentes familias de plaguicidas en población trabajadora, y un reciente estudio en China ha desarrollado un procedimiento para el análisis de retardantes de llama emergentes [22]. En el caso de recién nacidos, cada vez es más empleado el meconio para evaluar el grado de exposición tanto a metales [23] como de compuestos orgánicos de distinta polaridad [24]. Por último, se está explorando el análisis de aire exhalado, en especial para la determinación de compuestos de cierta volatilidad como las HAPs en personas con una elevada exposición laboral [25].
   
   Existen otras matrices alternativas que se están investigando, como semen, sudor o placenta. Sin embargo, estas aproximaciones no han llegado en general a aplicarse a estudios de HBM en población general debido en parte a la complejidad de realizar una correcta interpretación del grado de exposición. 

2. Disponer de unos tamaños o volúmenes de muestra pequeños, ha incentivado el desarrollo de nuevas estrategias basadas en la miniaturización, automatización y/o acoplamiento de las etapas de preparación de muestra [26]. Sin duda, esto ha sido posible gracias la sensibilidad y especificidad de las técnicas instrumentales. Desde hace algún tiempo se ha buscado esta reducción de volúmenes, en especial en el caso de las muestras de suero, sin que por ello se comprometa la precisión o la exactitud de la medida [15, 27]. En la actualidad se pretende ir más allá y realizar la determinación de los biomarcadores en una gota de sangre, que implicaría una diferente toma de muestra al ser recogida de manera similar a una prueba de azúcar en adultos o las pruebas de talón en recién nacidos. Así se ha evaluado la determinación de 43 PFAS en tan solo 25 µl de muestra [28]. 

Cabe señalar que todas estas aproximaciones en el campo de la preparación de muestra, en combinación con técnicas instrumentales que permitan un gran barrido de compuestos mediante “non target analysis” o con métodos multiresiduales, representa un camino prometedor para disponer de mayores y mejores herramientas en la caracterización de la exposición.

4. Aseguramiento y control de calidad

Reto 4. Desarrollo de estrategias y programas para el aseguramiento y control de la calidad.

Los valores guía en salud establecen la relación entre las concentraciones a las que un contaminante y/o sus metabolitos están presentes en nuestro organismo y sus potenciales efectos en la salud entre los que destacan los establecidos por la Agencia Alemana de Medioambiente con los “HBM values” [16]. Además, para una correcta evaluación de las políticas restrictivas puestas en marcha o para la elaboración de nuevas iniciativas, es importante conocer la tendencia de los niveles en la población a lo largo del tiempo y/o poder compararlos con los obtenidos en otros países. Por ello, en el campo del análisis de muestras humanas es crucial que la metrología proporcione medidas sensibles, exactas, precisas y robustas, de forma que se permita su comparabilidad a lo largo del tiempo y en relación con otros estudios. Para ello, los programas de control y aseguramiento de la calidad son imprescindibles. 

Sin embargo, en el análisis de muestras humanas nos encontramos con una serie de limitaciones que dificultan la validación externa de las metodologías y la implementación de un programa de aseguramiento de la calidad como las siguientes.

1. Materiales de referencia certificados en matriz.

El número de materiales de referencia con niveles de concentración certificados en muestras humanas, incluso en muestras biológicas en general, es realmente limitado y se centran en metales pesados en orina o sangre proporcionados por el NIST (National Institute of Standards and Technology of the US Department of Commerce) y por el JRC de la Comisión Europea, concretamente del Instituto de Materiales de Referencia (IRMM-JRC). En ambos casos no se encuentran referencias para la mayor parte de las familias de contaminantes ambientales orgánicos o sus metabolitos.

2. Ejercicios de intercomparación para la validación externa de los resultados

En el caso de los ejercicios de intercomparación, también en el campo de la determinación de muestras humanas hay importantes carencias, tanto en el número de biomarcadores incluidos (no incluyen biomarcadores emergentes), como por las altas concentraciones a las que están suplementadas las muestras, más cerca de la exposición ocupacional que de los niveles esperables en la población general. Algunos de los principales programas para el aseguramiento externo de la calidad son los desarrollados por el Centre de Toxicologie du Québec at the Institut National de Santé Publique du Quebec (https://www.inspq.qc.ca/en/ctq/eqas), que organiza los siguientes: AMAP Ring Test, para contaminantes orgánicos persistentes en muestras de suero y el QMEQAS y OSEQAS que incluyen biomarcadores orgánicos e inorgánicos en sangre y orina.

3. Patrones de calibración

Las limitaciones en este apartado son menores que en los otros dos, y se centran en la dificultad para encontrar patrones primarios de compuestos emergentes y especialmente los marcados isotópicamente. El empleo de estos patrones primarios marcados es necesario para la cuantificación mediante el método de dilución isotópica, para el que cada analito tiene su homólogo marcado que es añadido al inicio de la preparación de muestra. Este método de cuantificación es el más usado en la actualidad, ya que permite la reducción de la incertidumbre del procedimiento analítico. 

Parte de estas carencias vienen determinadas por el limitado número, aunque cada vez mayor, de laboratorios especializados en estudios de BMH, a diferencia de lo que ocurre en otros campos como el medioambiental o el análisis de alimentos con un recorrido e implantación mucho mayor tanto en el ámbito público como privado. La tendencia desde el punto de vista metrológico para abordar este reto ha sido la de aunar esfuerzos y aprovechar sinergias a nivel europeo. Con este objetivo, se puso en marcha un ambicioso programa de control y aseguramiento de la calidad en el marco de la iniciativa europea de biomonitorización humana denominada HBM4EU del horizonte 2020 (https://www.hbm4eu.eu). De esta forma, los laboratorios participantes, han podido disponer de materiales de referencia certificados a niveles realistas en la población general para determinadas familias de biomarcadores (metales, retardantes de llama bromados, retardantes de llama fosforados, PFAS, bisfenoles, hidrocarburos aromáticos policíclicos, ftalatos…). La selección de estas sustancias prioritarias se realizó a propuesta de los países participantes y de grupos de expertos, y presentó la ventaja de incluir algunos compuestos emergentes de interés como por ejemplo el DINCH o sustitutos del BPA. Así, este programa de aseguramiento de la calidad ha proporcionado una herramienta a los laboratorios analíticos de HBM, para la evaluación externa de los métodos propuestos y la armonización y comparabilidad de los resultados obtenidos. 

Por último, cabe señalar que esta línea de actuación a nivel europeo está previsto que se mantenga y consolide en los próximos años gracias al Partenariado Europeo para la Evaluación de Riesgos de Sustancias Químicas (PARC), que ha dado comienzo en mayo de 2022 y mantiene entre sus objetivos el establecimiento de una red europea de laboratorios de biomonitorización y su correspondiente red nacional de laboratorios.

5. Conclusiones

En la actualidad, la exposición humana a sustancias químicas se presenta como un escenario complejo, al que además de las exposiciones tradicionales relacionadas con la industria y la agricultura, hay que sumar la asociada a productos cotidianos de consumo. En este contexto los estudios de biomonitorización humana son la herramienta ideal para conocer el grado de exposición del individuo. La metrología, en este campo también ha evolucionado de la mano de los desarrollos técnicos e instrumentales, para dar respuesta a la necesidad de analizar cada vez más compuestos tóxicos y/o sus metabolitos, algunos de ellos emergentes, a bajas concentraciones, tal y como establece un marco regulatorio cada vez más restrictivo. Aproximaciones como el desarrollo de métodos rápidos, simples, miniaturizados y miltiresiduales, procedimientos basados en el análisis no dirigido, el empleo de muestras no invasivas o el fortalecimiento de programas de aseguramiento y control de calidad, se han revelado como caminos prometedores para un mejor y mayor control de la contaminación química y protección de nuestra salud. 

6. Referencias

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